Grant amount：\4810000 （ Direct Cost: \3700000 、 Indirect Cost：\1110000 ）

Although the SDN-POA was significantly larger in males than in females at PD15, the total numbers of neurons comprising the SDN-POA were not significantly different between sexes. Sexual dimorphism in the SDN-POA results from male-specific postnatal radial spreading of cells rather than cell proliferation during embryonic neurogenesis.

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Grant amount：\17450000 （ Direct Cost: \14300000 、 Indirect Cost：\3150000 ）

In the rat, estrogen determines sexual phenotype of the brain, acting at a critical period as neonates. The sexual phenotype thus established persists into adulthood, both in morphology and electrophysiology. In the adults, the volume of the sexually dimorphic nucleus of the preoptic area (SDN-POA) is larger in males than in females. The anteroventral periventricular nucleus (AVPV) is packed with estrogen receptor (ER) ss-positive neurons in females but these cells scatter in the more lateral areas in males. Estrogen regulates axonal excitability of projection neurons in the ventromedial hypothalamus and those in the preoptic area in diametrically opposite directions in females but not in males. Male phenotype depends on the presence of estrogen as neonates ; the lack leads to the female phenotype. This research project focused intracellular signal cascades, which are kindled by estrogen through estrogen receptor (ER) α and culminate in neurogenesis, migration or cell death. 1) By using 5'-RACE we identified a new leader exon and untranslated internal exons in ERα gene. These exons were used for site-specific transcription of ERα ; 2) In a trait of transgenic rat, which express EGFP under the control of ERα promoter 0/B, ERα-positive neurons in the SDN-POA, but not those in the adjacent areas, were fluorescent. Time lapse movies showed the establishment of the SDN-POA as a result of neuronal migration ; 3) In another trait of transgenic rat, in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons were tagged by EGFP, activation of GABAA_A receptors depolarized adult GnRH neurons due to their high chloride ion content ; 4) DNA microarray, PCR and Western-blot analysis demonstrated site-specific, opposite regulations of apoptosis- and migration-related genes in the SDN-POA and AVPV.

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Grant amount：\3300000 （ Direct Cost: \3300000 ）

性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンは脳による生殖内分泌調節の最終共通路であり、上位の脳機構からの支配を受けて、下垂体前葉を調節し性腺からのホルモン分泌調節や配偶子の形成を行っている。上位の脳機構についてはほとんどわかっていない。γ-アミノ酪酸(GABA)A受容体(GABA_AR)を介するGABA、AMPA受容体を介するグルタミン酸、キスペプチンなどのペプチドがGnRHニューロンの活動を調節すると考えられている。本研究では当初、古典的経シナプス性制御に着目し、無毒化した破傷風毒素(TTC)が神経活動依存的に逆行性系シナプス性標識を行うという特徴を活用し、GnRHニューロンに投射しているニューロンをトランスジェニックラットで可視化することを試みた。GnRHプロモーターの下流に蛍光蛋白であるEGFPとTTC遺伝子をつなげた導入遺伝子を用い、4系統のトランスジェニックラットを得、サザンブロット法によりこれらのラットに遺伝子導入が起こっていることを確認し表現型を検討したが、何れの系統においても脳内GnRHニューロンあるいは他のニューロンにEGFP標識が見られなかった。性腺摘除を行ってフィードバック環を開放してGnRHニューロンの過剰な活動を起こしたり、経代を重ねることで目的の表現型が得られるかについても検討したが、計画年度内には成功に至らなかった。一方、蛍光タンパク遣伝子の導入により、可視化したラットGnRHニューロンを対象とする実験では、GnRHニューロンにGABA_ARのα2,β3,γ1またはγ2サブユニットが発現していることをRT-PCR法で確認し、グラミシジン穿孔パッチクランプ法により、GnRHニューロンでは細胞内塩素イオン濃度が高く、成熟後もGABA_ARの活性化が脱分極を起こすこと、低濃度のGABAは活動電位の発生を促すが、高濃度では脱分極ブロックにより、活動電位の発生を抑えることを見いだし報告した(Yin etal.,2008)。gabazineによるGABA_A電流の阻止効果が限定的であったこと、この実験における低濃度のGABAは前脳底部におけるシナプス外GABAの濃度に相当することの2点から、シナプス外のGABA_ARの活性化がGnRHニューロンの調節に大きな役割を果たしていることが示唆され、本実験計画の当初の仮説の妥当性を考え直す契機となった。以上、本研究計画は当初の成果を挙げられなかったが、GnRHニューロン、ひいては視床下部ペプチド作動性ニューロンの調節一般について、古典的考え方にとらわれない新規な発想を導くに至った点で、有益であった。

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Authorship：Principal investigator  Grant type：Competitive

Grant amount：\3710000 （ Direct Cost: \3500000 、 Indirect Cost：\210000 ）

Estrogen plays an essential role for reproduction, plasticity and neuroprotection to affect on the central nervous system. The purpose of the present study is to examine the mechanisms of estrogen action using the visualized neurons that are responsible to estrogen in the estrogen receptor gene promoter transgenic rats. Most important result is that EGFP expression under the control of estrogen receptor gene promoter is a specific marker for the sexually dimorphic nucleus of the preoptic area. Because sexual dimorphism of this nucleus is established by estrogen during the perinatal period, the new, live marker would contribute to clarify the molecular mechanisms of the sexual differentiation. On the other hand, EGFP expression is observed in the hippocampus that is noted function of estrogen for the plasticity and neurogenesis. We determined acute and chronic effects of physiological concentration of estrogen on the outward potassium currents in the primary cultured EGFP hippocampal neurons. Immature neurons showed the facilitated effect of 48 h treatment of estrogen, however, mature neurons exhibited the suppressive effect on the outward potassium currents. After the 48 h treatment of estrogen, bath application of 250 pM estrogen enhanced the potassium currents. These results suggest that estrogen influence the development and excitability of hippocampal neurons. One more thing to be noted is that there is the sex difference in the number of EGFP expressed cells in the area postrema and the nucleus tractus solitarius that are known to play an important role for cardiovascular regulation. Because hypertension is inhibited by estrogen in female, we could expect to clear the mechanisms of estrogen function on the cardiovascular regulation. Thus, we can show a number of the important results and we would like to study further to make clear the molecular mechanisms of estrogen function in the central nervous system.

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Grant amount：\120000000 （ Direct Cost: \120000000 ）

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Grant amount：\3200000 （ Direct Cost: \3200000 ）

視床下部に散在している性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンは、生殖内分泌系を調節する最終共通路であるが、支配する神経回路についてはほとんどわかっていない。本研究では、トランスジェニックラットにおいて逆行性トレーサーをGnRHニューロン特異的に発現させ、経ナプス的に支配ニューロンを可視化することを目論んだ。すなわち蛍光タンパク質(EGFP)と無毒化テタヌストキシンC末端(TTC)の融合タンパク質を逆行性トレーサーとして用いた。前年度に作製したGnRHプロモーター-EGFP-TTCという導入遺伝子をラット受精卵に注入し、4系統のファウンダーラットを得た。サザンブロットの結果から導入された遺伝子は1コピー(1)、100コピー(2)および300コピー(1)と推定され、これまでの当研究室でのトランスジェニックラット作出の経験から、表現型発現が期待されるレベル(100-300)にあることがわかった。野生型と交配しそれぞれ産仔を得たが、ある系統では産仔に導入遺伝子がまったく伝達されなかった。また別の系統では雌のみに導入遺伝子が伝達され、このファウンダーが雄だったことから、導入遺伝子がX染色体上にあることが示唆された。他の2系統はメンデルの法則に則って産仔が得られた。これら産仔(4週令と7週令)の脳切片を作成し、EGFP蛍光発現を検討したが、どの系統も蛍光は観察されなかった。発現したEGFP分子が蛍光として可視されるほど多くないことを予想してGFPに対する兔疫染色を試したが、これもまったく染色されなかった。
これらの結果は遺伝子導入実現が必ずしも表現型として表出されるとは限らないというトランスジェニックの宿命のためであると考えられる。現在更に系代し、表現型の確認を進めるとともに、導入遺伝子の更なる受精卵移植を検討しているところである。

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Grant amount：\14600000 （ Direct Cost: \14600000 ）

Transgenic rats expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under the control of an estrogen receptor (ER) alpha promoter were generated to tag ERalpha-positive neurons in the brain. Two transgenes, one containing sequences for promoter A and DsRed and the other containing sequences for promoter 0/B and EGFP, were injected simultaneously into Wistar rat zygotes. Twenty-two founders with both transgenes were identified. Ten lines of these founders expressed the EGFP tag in the brains of their first filial generation, whereas none similarly expressed the DsRed tag. In two lines selected for the brightness of the EGFP fluorescence in their brains, tagged cells showed essentially the same patterns. Tagged cells were in the preoptic area (POA), bed nucleus of the stria terminalis (BNST), hypothalamic arcuate nucleus and medial amygdala. ERalpha-immunoreactive neurons were identified in all of these structures by immunohistochemistry. In ovariectomized females, approximately 75% of the EGFP-fluorescent cells in the POA-BNST were immunoreactive for ERalpha. In the POA-BNST, ovariectomy increased the number of EGEP-immunopositive cells and estrogen supplementation reversed this effect, indicating that the promoter 0/B is involved in estrogen-induced downregulation of ERalpha. EGFP was also present in cells in the cerebral cortex and hippocampus, which have not previously been associated with endocrine regulation. Conversely, only a few cells were tagged in the hypothalamic ventromedial nucleus, which contained many ERalpha-immunoreactive neurons. This discrepancy could have arisen as a result of differential promoter usage.

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Authorship：Principal investigator  Grant type：Competitive

Grant amount：\3100000 （ Direct Cost: \3100000 ）

エストロジエン受容体(ER)トランスジェニック(TG)ラットを用いた検討これまでの研究により、α型ERを発現するニューロンを生きた状態で可視化されるTGラットの作製に成功した。すなわち、ラットα型ER遺伝子プロモーターのひとつであるプロモーターO/Bの下流に、GFP遺伝子を結合させた導入遺伝子を用いることで、雌型性行動に対し抑制的に働く視索前野にGFPを発現するTGラットを得た。視索前野に存在するGFP発現細胞の70%は免疫組織学的にERを発現し、このGFP発現はERと同様にエストロジェンによってdown-regulateされていることから、プロモーターO/BがERのdown-regulationに関わっていることが明らかとなった(論文投稿中)。複数存在するER遺伝子プロモーターの機能的差異についてはほとんどわかっておらず、本研究の結果によりその一端が明らかとなった。また同時にER遺伝子プロモーターの制御下で発現したGFP蛍光を指標として、これまで困難であったER発現ニューロンを生きた状態で可視化することが可能となった。これら視索前野GFP発現細胞を用いた、エストロジェン作用に関する電気生理学的な研究を現在進めている。一方で雌型性行動に対し促進中枢と考えられ、BRの局在が観察される視床下部腹内側核にはほとんどGFPは発現していなかった。このことは視索前野と腹内側核で機能しているER遺伝子プロモーターが異なることを示唆している。以上のように雌型行動神経回路を可視化する目的で作製したTGラットを用いることで、本来の目的を達しただけでなく、これまで不明であった多種類ER遺伝子プロモーターの存在意義について重要な知見が得られた。特に雌の性行動に対し拮抗的に働いている二つの神経核で、異なるプロモーターが機能しているということは興味深く、今後の研究進展が期待される。

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Authorship：Principal investigator  Grant type：Competitive

Grant amount：\2000000 （ Direct Cost: \2000000 ）

発情期のげっ歯類の雌に見られるエストラジオール(E_2)依存性のロードシス発現には、中脳灰白質(PAG)に投射している視床下部腹内側核(VMH)のE_2感受性ニューロンが重要な役割を演じている。このニューロンに関する細胞レベルでの生理学的特性を明らかにするために、前年度の結果(投稿準備中)より、後部PAGの腹側に逆行性トレーサーを注入することで、生きた状態で蛍光ラベルされたVMHニューロンについてslice patch clamp法を用いた電気生理学的な検討を行った。まず視床下部で重要なトランスミッターであるGABAに対する反応性について検討を試みたが、細胞が非常に脆弱で、あまりデータが得られなかった。この原因は同条件で視索前野ニューロンについて記録可能であるためVMHニューロンの性質に起因すると考えられるが、一方で蛍光トレーサーの副作用である可能性も考えられる。現在、視床下部スライス作製時の条件の再検討を行っている。また実験計画には記載されていなかったが、E2感受性ニューロン、さらに言えばエストロジェン受容体を含有するニューロンを生きた状態で可視化する目的で、α型ER遺伝子のプロモーターに蛍光タンパクであるGFPを結合させたトランスジェニックラットを作製した。GFPの蛍光は脳内で確認され、視床下部のみならず、大脳皮質や海馬にもGFPでラベルされたニューロンが存在しており、免疫組織化学的にα型ERとの共存も確認された。今後はこのトランスジェニックラットのPAGに逆行性トレーサーを注入し、GFPと二重ラベルされた細胞について膜特性、特にエストロジェンの作用に着目して電気生理学的な研究を進めて行くつもりである。

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