配分額：4810000円 （ 直接経費：3700000円 、 間接経費：1110000円 ）

視索前野性的二型核(SDN-POA)の細胞新生は雌雄ともに胎生期18日にもっとも多く認められたが、これら生後の神経核を形成する細胞総数に性差は認められなかった。ソマトスタチン発現細胞の発達時期による分布状況からSDN-POAの性差形成には、生後の細胞新生による増加というよりは、雄においてニューロンが神経核の中心から放射状に側方に移動したため性差が形成されたと推察された。

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配分額：17450000円 （ 直接経費：14300000円 、 間接経費：3150000円 ）

ラットの脳は雌型がデフォルトで、周産期におけるエストロゲン作用で雄型化する。神経細胞の分布に見られる性差は細胞死・移動・新生何れかの結果である。本研究計画ではエストロゲンにより制御される遺伝子カスケードがどの機構を動かすか分子生物学・形態学・電気生理学・行動生理学的手法を用いて調べた。これまで完全でなかったラットのエストロゲン受容体(ER)αの部位特異的発現に関わる遺伝子の制御領域を解明し、この部位に蛍光タンパク遺伝子を結合した人工遺伝子の導入したところ視索前野の性的二型核の神経細胞に雌雄共に蛍光標識が現れた。生殖内分泌機能調節の最終共通路である性腺刺激ホルモン放出ホルモン産生ニューロンでは脳の形態形成の時期にも成熟ラットでもγアミノ酪酸により脱分極が送ることを見いだした。脱分極により細胞内カルシウム濃度が上昇すると細胞死や細胞移動が起こる機序を解明することができた。

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配分額：3300000円 （ 直接経費：3300000円 ）

性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンは脳による生殖内分泌調節の最終共通路であり、上位の脳機構からの支配を受けて、下垂体前葉を調節し性腺からのホルモン分泌調節や配偶子の形成を行っている。上位の脳機構についてはほとんどわかっていない。γ-アミノ酪酸(GABA)A受容体(GABA_AR)を介するGABA、AMPA受容体を介するグルタミン酸、キスペプチンなどのペプチドがGnRHニューロンの活動を調節すると考えられている。本研究では当初、古典的経シナプス性制御に着目し、無毒化した破傷風毒素(TTC)が神経活動依存的に逆行性系シナプス性標識を行うという特徴を活用し、GnRHニューロンに投射しているニューロンをトランスジェニックラットで可視化することを試みた。GnRHプロモーターの下流に蛍光蛋白であるEGFPとTTC遺伝子をつなげた導入遺伝子を用い、4系統のトランスジェニックラットを得、サザンブロット法によりこれらのラットに遺伝子導入が起こっていることを確認し表現型を検討したが、何れの系統においても脳内GnRHニューロンあるいは他のニューロンにEGFP標識が見られなかった。性腺摘除を行ってフィードバック環を開放してGnRHニューロンの過剰な活動を起こしたり、経代を重ねることで目的の表現型が得られるかについても検討したが、計画年度内には成功に至らなかった。一方、蛍光タンパク遣伝子の導入により、可視化したラットGnRHニューロンを対象とする実験では、GnRHニューロンにGABA_ARのα2,β3,γ1またはγ2サブユニットが発現していることをRT-PCR法で確認し、グラミシジン穿孔パッチクランプ法により、GnRHニューロンでは細胞内塩素イオン濃度が高く、成熟後もGABA_ARの活性化が脱分極を起こすこと、低濃度のGABAは活動電位の発生を促すが、高濃度では脱分極ブロックにより、活動電位の発生を抑えることを見いだし報告した(Yin etal.,2008)。gabazineによるGABA_A電流の阻止効果が限定的であったこと、この実験における低濃度のGABAは前脳底部におけるシナプス外GABAの濃度に相当することの2点から、シナプス外のGABA_ARの活性化がGnRHニューロンの調節に大きな役割を果たしていることが示唆され、本実験計画の当初の仮説の妥当性を考え直す契機となった。以上、本研究計画は当初の成果を挙げられなかったが、GnRHニューロン、ひいては視床下部ペプチド作動性ニューロンの調節一般について、古典的考え方にとらわれない新規な発想を導くに至った点で、有益であった。

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担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：3710000円 （ 直接経費：3500000円 、 間接経費：210000円 ）

エストロジェンは中枢神経に作用し、生殖内分泌調節に加え、シナプス可塑性、神経保護作用などに中心的な役割を演じている。本研究の目的は、我々が作出したエストロジェン受容体遺伝子プロモータートランスジェニックラットにおけるEGFPにより可視化されたエストロジェン感受性ニューロンを用い、エストロジェンの様々な機能について細胞レベルで検討することである。研究期間内の成果のうち、最も意義深いものは、EGFP発現が視索前野性的二型核の新規特異的マーカーとして活用できることが明らかとなった点である。この神経核は周生期のエストロジェンにより雌雄差が形成されるが、特に生きた状態で活用できる特徴を生かすことで、このEGFP発現がその性分化機構解明のツールとして、貢献することが期待される。一方、可塑性や神経新生に対するエストロジェンの作用が注日されている海馬にもEGFP発現が観察される。このEGFP発現初代培養細胞を用い、カリウム電流に対する生理学的濃度のエストロジェンの急性および慢性効果を電気生理学的に明らかにした。48時間のエストロジェン曝露では、培養10日まではカリウム電流促進効果、12日以降は逆に抑制効果が、また48時間曝露した細胞にエストロジェンを急性投与すると促進効果が観察され、エストロジェンは海馬ニューロンの発達や興奮性に影響を与えていることが示唆された。もう一点特筆すべきことは、血圧調節に重要な最後野や弧束核にEGFPの発現が認められ、最後野では雄より雌でEGFP発現細胞数が多かったことである。雌では血圧上昇がエストロジェンによって抑制されることが知られており、血圧調節の性差についても今後の研究進展が期待される。以上の様にエストロジェンの多機能性について様々な知見を得ることができた。今後は更に詳細な作用機構の解明を目指していきたい。

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配分額：120000000円 （ 直接経費：120000000円 ）

本研究計画は、生殖内分泌調節や行動パターンに見られる性差の神経学的基盤となっている脳の性分化に関わる分子メカニズムの解明を目的として実施した。ラットの脳は周産期におけるエストロゲンの作用で雄型化するので、この時期にエストロゲンにより制御される遺伝子の同定、転写・翻訳ならびにその結果生じる脳機能の表現型である伝達物質、受容体、トランスポータ分子、チャネルを、分子生物学・電気生理学・行動学的手法を用いて研究を進めた。MCF-7細胞におけるエストロゲン反応性を指標に作成したfocused cDNA microarrayを使用して、雌が多数の細胞を擁する前腹側室周核と雄が多数の細胞を擁する内側視索前夜の性的二型核のそれぞれで、出生直後からの脳の性分化の起こる時期に賦活・抑制される遺伝子をスクリーニングし、選択的細胞死と細胞移動に関わる遺伝子群がエストロゲンに反応すること、さらにreal time PCR、ウエスタンブロットによるタンパク同定により、実際にこれらの機構により二つの部位の性差が成立することを解明した。ニューロンへのBrdU取り込みはエストロゲン感受性期には起こらないことから、エストロゲン依存性性分化に細胞新生が関与する可能性は考えにくいと結論した。

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配分額：3200000円 （ 直接経費：3200000円 ）

視床下部に散在している性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンは、生殖内分泌系を調節する最終共通路であるが、支配する神経回路についてはほとんどわかっていない。本研究では、トランスジェニックラットにおいて逆行性トレーサーをGnRHニューロン特異的に発現させ、経ナプス的に支配ニューロンを可視化することを目論んだ。すなわち蛍光タンパク質(EGFP)と無毒化テタヌストキシンC末端(TTC)の融合タンパク質を逆行性トレーサーとして用いた。前年度に作製したGnRHプロモーター-EGFP-TTCという導入遺伝子をラット受精卵に注入し、4系統のファウンダーラットを得た。サザンブロットの結果から導入された遺伝子は1コピー(1)、100コピー(2)および300コピー(1)と推定され、これまでの当研究室でのトランスジェニックラット作出の経験から、表現型発現が期待されるレベル(100-300)にあることがわかった。野生型と交配しそれぞれ産仔を得たが、ある系統では産仔に導入遺伝子がまったく伝達されなかった。また別の系統では雌のみに導入遺伝子が伝達され、このファウンダーが雄だったことから、導入遺伝子がX染色体上にあることが示唆された。他の2系統はメンデルの法則に則って産仔が得られた。これら産仔(4週令と7週令)の脳切片を作成し、EGFP蛍光発現を検討したが、どの系統も蛍光は観察されなかった。発現したEGFP分子が蛍光として可視されるほど多くないことを予想してGFPに対する兔疫染色を試したが、これもまったく染色されなかった。
これらの結果は遺伝子導入実現が必ずしも表現型として表出されるとは限らないというトランスジェニックの宿命のためであると考えられる。現在更に系代し、表現型の確認を進めるとともに、導入遺伝子の更なる受精卵移植を検討しているところである。

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配分額：14600000円 （ 直接経費：14600000円 ）

エストロゲン受容体α(ERα)は、ヒトゲノムでは少なくとも7つのプロモータ配列が同定されるなど、複数のプロモータにより部位・時期特異的な発現制御を受けることが想定されているが詳細は未だ不明である。本研究計画は、ラットのプロモータ0/B(Gene Bank Map No.1-2186,2.2kb)によりEGFPの遺伝子(クローンテック社)を発現するトランスジェニック系統を樹立し、ERα陽性ニューロンを可視化して当該プロモータの機能を明らかにするばかりでなく、同定されたニューロンを神経内分泌学的、細胞生理学的研究に供する目的で開始した。計画年度内にトランスジェニックラットの作成に成功し、脳ではERαの存在が免疫組織学的に確認される視索前野ならびに分界条床核のニューロンにEGFPを発現する系統を確立することができた。これらの部位におけるEGFPの発現は卵巣摘除により増加し、エストロゲン投与により減少したことから、エストロゲンによる性腺刺激ホルモン分泌のネガティブフィードバックに関わるニューロンが標識されると結論した。一方、視床下部腹内側核のERα免疫陽性ニューロンには見るべきEGFP発現が起こらず、この部位のERαはプロモーター0/Bの調節のもとにはないと考えられる結果を得た。一連の結果はMoecularl Brain Research 139(1):42-51(2005)に発表したが、引き続き解析を進めたところ、免疫組織学的研究では従来ERαの存在が疑問視され、性分化の機序について議論の絶えなかった内側視索前野の性的二型核(SDN-POA)ニューロンがEGFPを発現しており、免疫組織学的学的にもERα陽性であるとの所見を得た。免疫学的手法による先行研究がERαを検出しなかったのは、SDN-POAが周辺の多数のERα免疫陽性ニューロン群に埋没したためと考えており、ERα分子のみでなく、プロモー一タの使い分けに注目することで、SDN-POAの形態形成や生理機能など、予期していなかった使用価値があるトランスジェニック系統を得ることができた。

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担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：3100000円 （ 直接経費：3100000円 ）

エストロジエン受容体(ER)トランスジェニック(TG)ラットを用いた検討これまでの研究により、α型ERを発現するニューロンを生きた状態で可視化されるTGラットの作製に成功した。すなわち、ラットα型ER遺伝子プロモーターのひとつであるプロモーターO/Bの下流に、GFP遺伝子を結合させた導入遺伝子を用いることで、雌型性行動に対し抑制的に働く視索前野にGFPを発現するTGラットを得た。視索前野に存在するGFP発現細胞の70%は免疫組織学的にERを発現し、このGFP発現はERと同様にエストロジェンによってdown-regulateされていることから、プロモーターO/BがERのdown-regulationに関わっていることが明らかとなった(論文投稿中)。複数存在するER遺伝子プロモーターの機能的差異についてはほとんどわかっておらず、本研究の結果によりその一端が明らかとなった。また同時にER遺伝子プロモーターの制御下で発現したGFP蛍光を指標として、これまで困難であったER発現ニューロンを生きた状態で可視化することが可能となった。これら視索前野GFP発現細胞を用いた、エストロジェン作用に関する電気生理学的な研究を現在進めている。一方で雌型性行動に対し促進中枢と考えられ、BRの局在が観察される視床下部腹内側核にはほとんどGFPは発現していなかった。このことは視索前野と腹内側核で機能しているER遺伝子プロモーターが異なることを示唆している。以上のように雌型行動神経回路を可視化する目的で作製したTGラットを用いることで、本来の目的を達しただけでなく、これまで不明であった多種類ER遺伝子プロモーターの存在意義について重要な知見が得られた。特に雌の性行動に対し拮抗的に働いている二つの神経核で、異なるプロモーターが機能しているということは興味深く、今後の研究進展が期待される。

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担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：2000000円 （ 直接経費：2000000円 ）

発情期のげっ歯類の雌に見られるエストラジオール(E_2)依存性のロードシス発現には、中脳灰白質(PAG)に投射している視床下部腹内側核(VMH)のE_2感受性ニューロンが重要な役割を演じている。このニューロンに関する細胞レベルでの生理学的特性を明らかにするために、前年度の結果(投稿準備中)より、後部PAGの腹側に逆行性トレーサーを注入することで、生きた状態で蛍光ラベルされたVMHニューロンについてslice patch clamp法を用いた電気生理学的な検討を行った。まず視床下部で重要なトランスミッターであるGABAに対する反応性について検討を試みたが、細胞が非常に脆弱で、あまりデータが得られなかった。この原因は同条件で視索前野ニューロンについて記録可能であるためVMHニューロンの性質に起因すると考えられるが、一方で蛍光トレーサーの副作用である可能性も考えられる。現在、視床下部スライス作製時の条件の再検討を行っている。また実験計画には記載されていなかったが、E2感受性ニューロン、さらに言えばエストロジェン受容体を含有するニューロンを生きた状態で可視化する目的で、α型ER遺伝子のプロモーターに蛍光タンパクであるGFPを結合させたトランスジェニックラットを作製した。GFPの蛍光は脳内で確認され、視床下部のみならず、大脳皮質や海馬にもGFPでラベルされたニューロンが存在しており、免疫組織化学的にα型ERとの共存も確認された。今後はこのトランスジェニックラットのPAGに逆行性トレーサーを注入し、GFPと二重ラベルされた細胞について膜特性、特にエストロジェンの作用に着目して電気生理学的な研究を進めて行くつもりである。

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